问答题
我们实验室研究生做了一个如下的实验:将pdc基因(丙酮酸脱羧酶)克隆到pUC18载体中,以便在E.coli TOP10中表达,这个pdc基因两侧具有BamHI的位点,因此计划将它从BamHI的位点插入载体中。实验严格按分子克隆实验手册中进行:载体用BamHI切割后,立即用碱性磷酸酶处理,接着将处理过的载体同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4连接酶进行温育,连接后,将DNA同处理过的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受态细胞混合。最后将混合物涂布在加有氨苄青霉素、IPTG和x-gal固体培养基的平板上。 实验中同时设置了4个对照: 对照1:将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上。 对照2:将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。 对照3:将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用T4连接酶连接(但没有pdc基因)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。 对照4:将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用T4连接酶连接(但没有pdc基因)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。 在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(见下表1)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没菌落生长(见下表1)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(见下表1)。从实验平板上挑出12个菌落,分离质粒DNA,并用BamHI进行切割,其中9个克隆产生大小同载体pUC18一样的单一的一条带,另3个克隆中切出一个pdc基因,实验终于获得成功。
你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?
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问答题 现为了确保分离纯化,决定将一段6个组氨酸的短肽分别加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同A蛋白柱结合,但很容易被EDTA溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。请你设计一对PCR引物,各含有10个同该基因同源的核苷酸,能够用于扩增该基因的编码序列,另外,在N端有一个起始密码,其后是6个组氨酸密码子(CAC)?另设计一对引物,能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码?
问答题 请选择一个合适的载体,试述该段cDNA序列克隆在载体中并导入大肠杆菌中表达的全过程?
问答题 请问这段cDNA序列要在大肠杆菌中表达应当还需考虑一些什么问题?